SDS page

Jo den kvarternære kan brydes ved opvarmning af dine prøver, men det er ikke nødvendigvis at den gør det. Hvis den tertiære struktur holdes sammen af disulfid broer, så vil varme ikke gøre nogen forskel. Hår går heller ikke i stykker af, at du koger der i vand og det indeholder mange disulfid broer for at give hår sin struktur. Det er her Dithiothreitol eller Mercaptoethanol kommer ind i billedet. Du kan bryde disse disulfid broer med disse stoffer og derved også den kvarternære struktur. 

Hvad har i brugt til at reducere den alkaliske fosfatase, før SDS page? Mit bud ville være at køre den SDS page igen, men denne gang så lav en lane/brønd mere, til den reducerede+DTT, dette vil vise om i overhovedet har haft en succesfuld reducering af prøven.

Hej. jef skal lige forstå dig ret: hvis den tertiære struktur er opbygget af disulfid bindinger vil varme ikke kunne bryde den kvarternære struktur, er det rigtig forstået? Vi har anvendt DTT til reducering. I morgen vil vi køre en gel ikke-reduceret prøver. Vil du så foreslå at vi kører en reduceret i en brønd? Reduceringen var nemlig succesfuld kan vi se ud fra vægtstandarden, men den ikke-reduceret blev også reduceret. Derfor vil vi prøve at lade være med at varme prøven op, men vi havde forstået at med SDS er det nødvendigt at varme det op. Men det kan være varmen blot er en katalysator?

Som udgangspunkt kræver det intens varme at bryde en disulfid bro, det er derfor man bruger reduktionsmidler som β-mercaptoethanol eller Dithiothreitol. Hvis i skal have SDS til at virke ordentligt så skal proteiner denatureres først, ellers får i ikke 1 SDS per 2 aminosyrer, da SDS ikke vil kunne binde jævnt intramolekylært. Hvis i vil denaturerer jeres prøver uden varme, så kan i gøre det med koncentreret Urea ved stuetemp. Urea har som regel en fordel, da det kan give skarpere bånd, så hvis der er to bånd tættere på hinanden så vil de nemmere kunne adskilles. 

Personligt ville jeg lave en ny ikke reduceret prøve. Derefter så ville jeg denaturere mine prøver med konc. Urea + SDS loading buffer og så ville jeg køre et sæt med prøver uden reduktionsmiddel, samt et sæt med β-mercaptoethanol som reduktionsmiddel.

Så disulfid broerne skal brydes før sds kan virke?

Nej men dit protein skal denatureres, enten ved varme eller Urea, så SDS kan bindes jævnt. Du bruger jo SDS som adskilningsstof, da det er negativt ladet. F.eks du har to prøver med samme protein i, hvis begge prøver ikke har den samme mængde SDS bundet, så vil de vandre forskelligt i din polyacrylamidgel, selv om at de er 100% ens som udgangspunkt. 

Men du siger at din ikke-reducerede prøve, er blevet reduceret --> lav en ny. Du har nok lavet en kontamination. Du siger også at i har brugt Dithiothreitol som reduktionsmiddel, hvis i tilsætter det til prøverne og lader dem stå, så sker der det at Dithiothreitol oxiderer og kan give misvisende resultater, derfor tilsætter man det altid lige inden, at man kører sin SDS page.

Altså både reduceret og ikke reduceret har fået samme resultat og de ligger hvor båndet for ikke reduceret skal ligge. Det eneste vi har gjort forskel er at den ene er tilsat DTT (lige inden kørslen) og det andet ikke er. Begge er opvarmet pga SDS. Jeg ved ikke om den ikke reduceret er blevet reduceret men det virker det til når den ligger hvor den ikke reduceret skal ligge.

Det tyder på at din reduktion er dårlig. Det ideelle forsøg ville køres med 5 lanes. 1) varme-denat. protein + SDS, 2) varme-denat. protein + SDS + DTT, 3) varme-denat. protein + SDS + 2-ME (beta-mercaptoethanol), 4) urea-denat. protein + SDS, 5) urea-denat. protein + SDS + 2-ME. Samt en marker/ladder.

Ja det har du ret i. Desværre har vi ikke tiden til det :( (det er eksamen) så må vi se om vi kan diskutere os ud af det. Men tusind tak for svar. Det har hjulpet rigtig meget

En anden ting jeg kom til at tænke på er: Hvilken procent polyacrylamid er din separationsgel? Hvis den er for tyk, så kan det være årsagen til at du ikke kan skelne din reducerede prøve fra den ikke-reducerede.

Tak. Det vil jeg lige kigge på i morgen