klipning med restriktionsenzymer

Figur 2 viser en gelelektroforese, hvor der helt til venstre er placeret et sæt markørsekvenser med kendte længder, som man bruger til at sammenligne med de andre prøver for dermed at forstå, hvor store fragmenterne er (hvor små stykker de er blevet klippet i af restriktionsenzymerne). Har I haft om gelelektroforese?

Markørsekvenserne er DNA-sekvenser med længderne 250 bp, 500 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp, 6000 bp, 7000 bp og 8000 bp, så ved at sammenligne hvor højt båndene ligger, kan man regner ud, hvor store ens fragmenter er. Hvis ens fragment (plasmidstykke) ligger lige så højt som markørsekvensen med længden 5000 bp, vil ens fragment også have en længde på ca. 5000 bp. Se evt. min vedlagte tegning :-)

Det ene plasmid, pBR 322, har tre viste kløvningssteder - ét for hvert restriktionsenzym. Det betyder, at fx HindIII kun vil kløve ét sted på pBR 322. Det samme vil EcoRI. Forestil dig, at du har en elastik, og du klipper ét sted. Så har du pludselig ét langt stykke i stedet for en 'cirkel'. Plasmidet er altså ikke blevet klippet i små stykker. Det er bare blevet åbnet. Derfor ser du også kun ét bånd på bane #2 og bane #4 fra venstre. Læg mærke til, at begge fragmenter ligger lige under 4000 bp, hvilket også passer med den længde, vi ser på figur 1 (hele plasmidet er lige under 4500 bp).

Det andet plasmid, pC 508, har to kløvningssteder for samtlige restriktionsenzymer, så det bliver klippet i to stykker - første klipning åbner ringen, og anden klipning kløver den i to. Det interessante at bemærke her er, at stykkerne ikke bliver lige lange, fordi kløvningsstederne sidder forskelligt.

For HindIII er der et kløvningssted ved ca. 1200 bp og endnu ét ved 6400 bp. Hele plasmidet er ca. 7200-7300 bp. 6400 bp - 1200 bp = 5200 bp. Det ene fragment vil altså ca. være 5200 bp, mens det andet fragment vil være 7200 bp - 5200 bp = 2000 bp. Det passer også med det, vi kan se på figur 2. Det øvreste bånd ligger cirka ud for 2000 bp, mens det nederste bund er lidt længere nede end 5000 bp, og derfor må være lidt længere end 5000 bp.

For EcoRI er der et kløvningssted ved 0 bp og endnu ét ved 5800 bp. Det er dejligt let at regne på - det ene fragment vil være 5800 bp, og det andet vil være 7200 bp - 5800 bp = 1400 bp. Det passer også med det, vi observerer. Der er ét fragment omkring 6000 bp og ét mellem 1000 bp og 2000 bp.

Giver det mening?

#1 Tusind tak for hjælpen. Jeg forstår opgaven nu og kan tolke figuren.