primere

Start med at opskrive den dobbeltstrengede sekvens

mener du DNA sekvens? 

jeg har fundet den ene fra ovenstående mRNA: 

5´ATGCGGGATCCGCCAA´3

men kan ikke finde den anden. 

Det er i princippet ligemeget om du opskriver den som DNA eller RNA sekvens. Men du skal opskrive den dobbeltstrengede sekvens. Jeg kan opskrive den for den første halvdel:
3'  ACGAATGCGGGATCCGCCAAC(...) - 5'

5' TGCTTACGCCCTAGGCGGTTG(...)- 3'

Prøv du at skrive op for hele mRNA'et (altså skriv 3' enden op i dobbeltstrenget).

3´CGTCGCCGTCCGTCGTCATTCGGA´5

5´GCAGCGGCAGGCAGCAGTAAGCCT´3

SÅDAN?

hvordan jeg skal finde primere? 

Du skriver nu det hele op på en linje så du har dit cDNA altså:

5’-ACGAATGCGGGATCCGCCAAC-----GCTGCGGCAGGCTGCAGTAAGCCA-3’

3' TGCTTACGCCCTAGGCGGTTG-----CGACGCCGTCCGACGTCATTCGGT5'

Det du ser ovenfor er som sagt cDNA og er det "mål" du går efter. For at nå derhen skal du have en primer i hver ende. De skal begge have en fri 3'-OH og være komplementære til hver deres streng. Først ser vi på forward primeren (den du også var begyndt at skrive op). Den skal være komplementær til - strengen (template streng) altså svarer den til kodende streng:

5’-ACGAATGCGGGATCCGCCAAC-----GCTGCGGCAGGCTGCAGTAAGCCA-3’ 

3' TGCTTACGCCCTAGGCGGTTG-----CGACGCCGTCCGACGTCATTCGGT5'

Altså skal (i følge opgaven) bare vælges 16 nt ud fra de almindelige kriterier (~50% GC, ingen sekundærstruktur, ingen overlap mellem primere, ingen repeats over 4 etc, slut på G el. C (med mindre stærk struktur lige før så gerne på A el. T)).

Her kunne fx tages de 16 første (selvom der er lidt overvægt af GC):

5' ACGAATGCGGGATCCG 3'

Så skal der laves en reverse primer. Den skal være komplementær til + strengen og svarer altså til -. strengen: (markeret med fed)

5’-ACGAATGCGGGATCCGCCAAC-----GCTGCGGCAGGCTGCAGTAAGCCA-3’ 

3' TGCTTACGCCCTAGGCGGTTG-----CGACGCCGTCCGACGTCATTCGGT5'

Igen skal der bare vælges 16 nt. Det kan du jo passende selv prøve.

skal mn ikke begynde med en startkodon? 

kan man bare vælge tilfældig? 

den du har lavet passer ikke med facit.: 

5’- ATGCGGGATCCGCCAA-3  ´

5 ´-CTGCAGCCTGCCGCAG-3

Der er ikke et reelt facit du kan lave primere på flere måder. Du behøver ikke starte med start codon, hvem ved om det overhovedet er start codon? Det kan være den har haft et signal peptid og det bare er en intern methionin eller at du læser, læserammen forkert. Du ved heller ikke om det er et mammalt gen og hvis det er et bakterielt gen findes der jo også andre start codons. 

men jeg vil vide hvordan de har fundet 

5 ´-CTGCAGCCTGCCGCAG-3 

????

5’-ACGAATGCGGGATCCGCCAAC-----GCTGCGGCAGGCTGCAGTAAGCCA-3’ 

3' TGCTTACGCCCTAGGCGGTTG-----CGACGCCGTCCGACGTCATTCGGT5'

3'GACGCCGTCCGACGTC-5' -> 5' - CTGCAGCCTGCCGCAG - 3'

Dog er det en virkelig dårlig primer. De har overset det inverterede repeat:

5' - CTGCAGCCTGCCGCAG - 3' 

Det inverterede repeat vil højst sandsynlig gøre primeren meget ueffektiv hvis ikke ubrugelig.

er der ingen regel om hvad den starter med og hvad den slutter med? kan jeg som primer nr 2 vælge: 

3´TCCGACGTCATTCGGT´5

Ja når du ikke har fået andet at vide. Der kan være specielle årsager til at gøre andre ting (lad os sige du vil indføre et restriktionssite, et his-tag eller lign.) Jeg vil endda sige at din nye primer er betydelig bedre end den i facit.

Dog er det konvention at skrive primere op i 5' -> 3' retningen så det ville jeg lige gøre hvis jeg var dig.

dvs.

5´TCCGACGTCATTCGGT´3

Nej nu har du bare skrevet 5' i 3' enden og 3' i 5' enden. Du skal vende sekvensen om altså:
5' TGGCTTACTGCAGCCT 3'

aha mange tak :))