Gensplejsning

Hejsa alle sammen! Jeg er ved at forberede en fremlæggelse om gensplejsning. Men jeg har et lille problem... som vi ved kan man føre et gen fra en organisme til en anden organisme ved hjælp af plasmider fra bakterier. Når man nu har et specialiceret traskriptionsenzym som klipper et specielt sted i DNA'et får man genet klippet ud(i den organsime hvor genet er, som man vil have).. fint! men hvordan får man det GEN transpoteret ud af cellen og over i plasmiden? Jeg ved godt at man bruger det samme enzym til at klippe det rigtige sted i plasmiden .... men hvordan tager man det klippede gen i den ønskede celle og over i plasmiden? (ALT DET ANDET VED JEG! Før og efter dette!) Plz hjælp!

her er en lille bid af min rapport:

Indsplejsning i en vektor:
Det stykke DNA man har indsættes i en vektor, hvor en vektor er defineret ved, at den har som funktion at overføre det ønskede DNA til modtagecellen. Det indsatte DNA skal gerne kunne have egenskaben til at replikere sig selv . Enten anvendes et plasmid eller et virus som vektor – i vores tilfælde et plasmid. Plasmid er et dobbeltstrengt (små ringformet) DNA-molekyle, som kun indeholder få gener, der forekommer i bakterier og fordobles uafhængigt af bakteriekromosomet.
På samme vis som man skaffer et donorgen skaffes plasmider fra bakterieceller: man isoler plasmidet ved knusning af bakterien, hvor man efterfølgende ved centrifugering adskiller de små plasmider fra det store bakteriekromosom. Her har man så plasmidet, nu ønskes det at få det ønskede donorgen indsat. Det kan lade sig gøre ved at åbne plasmiderne vha. de tidligere nævnte restriktionsenzym, som spalter fremmede DNA. Genet og plasmidet kan opnå at få de samme enkeltstrengede baser som er åbne i enderne – ved disse åbninger kan de lettere ”klistre sammen”.
Gensplejsning med plasmider har tre udfald, som ses på den nedenstående figur 2:
:
Af figuren ser vi de udfald som følgende:
1. Der forekommer en sammensplejsnig af plasmid og gen
2. Plasmidet lukker igen
3. Et plasmidring dannes ved sammenlukning af DNA-molekylet
Processerne fortsætter men tilførsel af DNA-ligase, hvilket er et enzym som ved dannelse af de nødvendige hydrogenbindinger mellem de 2 DNA strenge sammenføjer de sammenklæbede DNA-molekyler – dertil bør vi vide, at dette enzym anvendtes til cellens replikation af DNA før en celledeling. Ved tilførsel af DNA-ligase kan genet siges at være splejset ind i plasmidet.
Nu er det jo langt fra tilfældet, at alle gener har den samme længde. Ved forekomst af længere gener (med indhold store mængder DNA) må restriktionsenzymet spalte genet flere steder – derfor er det nødvendigt at anvende en anden metode.
Ved den anden anvendte metode slår man generne mekanisk i stykker, således at der er nok lange DNA-stykker med et stort gen. Herved kan de klæbrige ender laves syntetisk: med f.eks. en polyA-kæde på genet og en polyT-kæde på plasmidet. De føres da sammen med ligase og evt. manglende nucleotider. For at illustrerer det beskrevet, kan vi se på figur 3:

Af denne figur ser vi gensplejsning med syntetiserede klæbrige ender. Vi ser ligeledes 4 rækker, som jeg kort vil beskrive:
1. Mekanisk spaltning af gen og plasmid
2. Til genet og det åbnede plasmid tilføres henholdsvis en enkeltstrenget polyA-kæde (genet) en enkeltstrenget polyT-kæde (plasmidet).
3. Vi ser, at der opstår to klæbrige ender, hvor gen og plasmid nu kan føres sammen. Dette er betinget af, at de 2 enkeltstrengede DNA- stykker nu er komplementære.
4. DNA-polymerase tilføres til de manglende nucleotider (T), hvor det hele afslutte med tilførelse af DNA-ligase.
 

Genoverførsel til modtagercelle
Vektoroverførelsen foregå ved transformation, altså gennem cellemembranen, når vektoren er et plasmid. Man ønsker at behandle modtagercellen således, membran bliver yderligere permeabel (gennemtrængelig) over for plasmider, hvilket foretages med behandling af Calciumioner (Ca2+) og kuldebehandling. Kuldebehandlingen stimulerer ligeledes cellemembranens permeabelitet. Transformation vil som følge ad denne behandling forgå meget lettere.
At det indsplejsede gen har en promot er vigtig – evt. kan man splejse genet sammen med promoteren før gensplejsning. Man kan få aflæst genet ofte, hvis man anvender den type promotor, som binder RNA-polymerasen stærkt, hvilket betyder at meget at det ønskede stof syntetiseres.
Overførslen sker ved transduktion ved tilfældet af at vektoren er et. I bakterien eller i et bakteriekromosom optages genet, når bakteriophagen afgiver sit DNA-indeholdende gensplejsede gen til bakterien. Herefter kan genet fulgt af translation transkriberes, hvor man benytter en bakterieophag, der ikke er dræbende overfor bakterie.
 

Udvælgelsen af de celler som har fået indsplejset det relevante gen
Ikke alle bakterier er blevet gensplejset efter en gensplejsning. Har man foretaget gensplejsningen med en blanding af gener og ikke det helt specifikke gen som man ønskede at frembringe, vil det da være nødvendigt lokaliserer de bakterier, der har fået indsat det rigtige gen. Til dette er det simpleste at finde bakterien danner det ønskede protein. Eftersom, at protein produceres i meget små mængder, kan det være problematisk at påvise det specifikke protein. Som løsning til at påvise proteinet benyttes antistof, er det da et enzym man ønsker at påvise, da skak man teste enzynets evne til at katalysere en proces.
Ved kendskab til genets baserækkefølge, kan man også direkte påvise, at bakterierne indeholder deytrelevante gen. Ved brug af plasmid som vektor findes der en anden metode. Man kan således fremstille DNA-probe, hvilket vil sige, at man kan fremstille et enkelstrenget DNA de er komplementær til en af strengene i genet.
Hydrogenbindinger bliver ved opvarmning enstrenget i de forskellige bakteriers DNA og ved tilsætning af DNA-proben vil den kunne binde sig til genet, hvor man på den måde kan få lokaliseret genet.
For at finde ud af hvilke bakterier, der har optaget det gensplejsede plasmid ser man på sortering af bakterier gensplejset med plasmider. Eks, kan bakterierne modtaget visse resistensgener, hvis plasmidet, der er anvendt har indehold gener for resistens mod antibiotika.