Biologi
SDS page
Vi har udført SDS-page med reducerede og ikke reducerede alkalisk fosfatase. Problemet er blot, at resultaterne er ens. den eneste forskel vi har gjort er ikke at tilføre DTT til de ikke-reducerede prøver. Jeg har hørt noget om, at opvarmningen der sker af prøverne inden de køres på gelet også vil kunne bryde den kvarternære struktur. er det derfor der ikke er en forskel på resulaterne? er der en der har prøvet at køre både reducerede og ikke-reducerede prøver med succes, som kan forklare hvilken forskel der har været i forberedelse af de to prøver og hvorfor. Vil SDS virke, hvis man ikke opvarmer de ikke-reducerede prøver?
Svar #1
19. juni 2016 af Ramming (Slettet)
Jo den kvarternære kan brydes ved opvarmning af dine prøver, men det er ikke nødvendigvis at den gør det. Hvis den tertiære struktur holdes sammen af disulfid broer, så vil varme ikke gøre nogen forskel. Hår går heller ikke i stykker af, at du koger der i vand og det indeholder mange disulfid broer for at give hår sin struktur. Det er her Dithiothreitol eller Mercaptoethanol kommer ind i billedet. Du kan bryde disse disulfid broer med disse stoffer og derved også den kvarternære struktur.
Hvad har i brugt til at reducere den alkaliske fosfatase, før SDS page? Mit bud ville være at køre den SDS page igen, men denne gang så lav en lane/brønd mere, til den reducerede+DTT, dette vil vise om i overhovedet har haft en succesfuld reducering af prøven.
Svar #2
19. juni 2016 af byskov12
Svar #3
19. juni 2016 af Ramming (Slettet)
Som udgangspunkt kræver det intens varme at bryde en disulfid bro, det er derfor man bruger reduktionsmidler som β-mercaptoethanol eller Dithiothreitol. Hvis i skal have SDS til at virke ordentligt så skal proteiner denatureres først, ellers får i ikke 1 SDS per 2 aminosyrer, da SDS ikke vil kunne binde jævnt intramolekylært. Hvis i vil denaturerer jeres prøver uden varme, så kan i gøre det med koncentreret Urea ved stuetemp. Urea har som regel en fordel, da det kan give skarpere bånd, så hvis der er to bånd tættere på hinanden så vil de nemmere kunne adskilles.
Personligt ville jeg lave en ny ikke reduceret prøve. Derefter så ville jeg denaturere mine prøver med konc. Urea + SDS loading buffer og så ville jeg køre et sæt med prøver uden reduktionsmiddel, samt et sæt med β-mercaptoethanol som reduktionsmiddel.
Svar #5
19. juni 2016 af Ramming (Slettet)
Nej men dit protein skal denatureres, enten ved varme eller Urea, så SDS kan bindes jævnt. Du bruger jo SDS som adskilningsstof, da det er negativt ladet. F.eks du har to prøver med samme protein i, hvis begge prøver ikke har den samme mængde SDS bundet, så vil de vandre forskelligt i din polyacrylamidgel, selv om at de er 100% ens som udgangspunkt.
Men du siger at din ikke-reducerede prøve, er blevet reduceret --> lav en ny. Du har nok lavet en kontamination. Du siger også at i har brugt Dithiothreitol som reduktionsmiddel, hvis i tilsætter det til prøverne og lader dem stå, så sker der det at Dithiothreitol oxiderer og kan give misvisende resultater, derfor tilsætter man det altid lige inden, at man kører sin SDS page.
Svar #6
19. juni 2016 af byskov12
Svar #7
19. juni 2016 af Ramming (Slettet)
Svar #8
19. juni 2016 af byskov12
Svar #9
19. juni 2016 af Ramming (Slettet)
Skriv et svar til: SDS page
Du skal være logget ind, for at skrive et svar til dette spørgsmål. Klik her for at logge ind.
Har du ikke en bruger på Studieportalen.dk?
Klik her for at oprette en bruger.