Gen isolation, ved gensplejsning

Polymerase chain reaction (PCR), med de rette primere, efterfulgt af en korrekt kløvning med bestemte restriktionsenzymer...

Okay, men jeg har ikke anvendt PCR.

Derimod har jeg fået:

Først laver et enzym en komplementær DNA-streng til mRNA, siden mRNA er enkeltstrenget. Dernæst fjerner et andet enzym mRNA-strengen hvorefter der til sidst dannes den komplementære DNA-streng af et tredje enzym. På denne måde får man en blanding af dobbeltstrengede DNA stykker
VI kommer dem da i vores coli bakterier..

Derefer har vi "bare" i vores plasmid nogle selektionsgener (for f.eks. tetracyklin og penicillin), og bruger disse til at udrense imellem de bakterier der ikke har optaget plasmiderne

Til sidst tilføjer vi en probe, og oprenser kolonien..

Er dette korrekt?

Ja, det lyder fint. Metoden du beskriver hedder RT-PCR (revers transkriptase-PCR), ikke for at forveksle det med Real Time-PCR (som også kaldes RT-PCR)...

Lidt teknisk: husk, dine DNA fragmenter skal indplementeres i plasmider, før du kan percipitere dem i bakterier (enten vha. heat shock eller calcium phosphate kit)

Jeg har uploaded en rapport/protokol, som jeg lavede for nogle år siden, som bl.a. også bruger den metode du beskriver. Den kan du finde her http://www.graduate.dk/Opgaver/298/GenetherapyoftheBRCA1geneinbreastcancercells.aspx


Ellers spørg, hvis du er i tvivl...

Held og lykke...

Gensplejsning
Der findes flere metoder til gensplejsning af bakterie, hvor jeg kort vil redegøre for de ikke anvendte (/de uvæsentligt) i forhold til vores forsøg. Efterfølgende vil jeg give en mere detaljeret gennemgang af den anvendte metode.
1) Isolering af gener fra DNA: ved denne metode er det ret så svært at lokalisere det specifikke gen man ønsker at anvende, eftersom organismen man vil hente genet far indeholder utallige antal af gener. I første omgang benytter man sig at hele organismens arvemateriale mht. til gensplejsning fa DNA-stykker, hvor man efterfølgende isolere mikroorganismerne, der har fået indsplejset det ønskede gen.

2) Isolering af gener ud fra mRNA: genet for insulin kan dannes med udgangspunkt i mRNA, eftersom netop mRNA koder for insulin. I Bugspytkirtlen er der insulinproducerende celler, hvor man kan isolere mRNA fra. De dobbeltstrengede DNA kan dannes ved revers transkriptase, hvor revers er et enzym der katalyserer dannelse af DNA som aftryk af RNA. Det dannede DNA for betegnelsen komplementær-DNA – også såkaldt cDNA. Her undgår man introns, som er et område indenfor et som, som ikke findes kopieret i et endelig genprodukt. Eftersom bakterie ikke har et enzymsystem til at fjerne fra introns fra det transskriberede RNA, ville der forvolde problemer ved direkte anvendelse af insulingenet i en bakterie. Problemet undgås ved netop brug af cDNA, som i øvrigt er dannet fra noget der ikke indeholder introns, nemlig mRNA. Ved denne metode er det et problem ikke at kunne isolere det ønskede mRNA.

3) Isolering af gener ved syntetisk dannet DNA: en syntetisering er muligt ved kendskab til genets baserækkefølge. Altså, kender man aminosyrerækkefølgen i det valgte protein som genet koder for, kan man ved hjælp af den genetiske kode konstruere en baserækkefølge og efterfølgende syntetisere genet.

Indsplejsning i en vektor:
Det stykke DNA man har indsættes i en vektor, hvor en vektor er defineret ved, at den har som funktion at overføre det ønskede DNA til modtagecellen. Det indsatte DNA skal gerne kunne have egenskaben til at replikere sig selv . Enten anvendes et plasmid eller et virus som vektor – i vores tilfælde et plasmid. Plasmid er et dobbeltstrengt (små ringformet) DNA-molekyle, som kun indeholder få gener, der forekommer i bakterier og fordobles uafhængigt af bakteriekromosomet.
På samme vis som man skaffer et donorgen skaffes plasmider fra bakterieceller: man isoler plasmidet ved knusning af bakterien, hvor man efterfølgende ved centrifugering adskiller de de små plasmider fra det store bakteriekromosom. Her har man så plasmidet, nu ønskes det at få det ønskede donorgen indsat. Det kan lade sig gøre ved at åbne plasmiderne vha. de tidligere nævnte restriktionsenzym, som spalter fremmede DNA. Genet og plasmidet kan opnå at få de samme enkeltstrengede baser som er åbne i enderne – ved disse åbninger kan de lettere ”klistre sammen”.
Gensplejsning med plasmider har tre udfald, som ses på den nedenstående figur 2:
:
Af figuren ser vi de udfald som følgende:
1. Der forekommer en sammensplejsnig af plasmid og gen
2. Plasmidet lukker igen
3. Et plasmidring dannes ved sammenlukning af DNA-molekylet
Processerne fortsætter men tilførsel af DNA-ligase, hvilket er et enzym som ved dannelse af de nødvendige hydrogenbindinger mellem de 2 DNA strenge sammenføjer de sammenklæbede DNA-molekyler – dertil bør vi vide, at dette enzym anvendtes til cellens replikation af DNA før en celledeling. Ved tilførsel af DNA-ligase kan genet siges at være splejset ind i plasmidet.
Nu er det jo langt fra tilfældet, at alle gener har den samme længde. Ved forekomst af længere gener (med indhold store mængder DNA) må restriktionsenzymet spalte genet flere steder – derfor er det nødvendigt at anvende en anden metode.
Ved den anden anvendte metode slår man generne mekanisk i stykker, således at der er nok lange DNA-stykker med et stort gen. Herved kan de klæbrige ender laves syntetisk: med f.eks. en polyA-kæde på genet og en polyT-kæde på plasmidet. De føres da sammen med ligase og evt. manglende nucleotider. For at illustrerer det beskrevet, kan vi se på figur 3:

Af denne figur ser vi gensplejsning med syntetiserede klæbrige ender. Vi ser ligeledes 4 rækker, som jeg kort vil beskrive:
1. Mekanisk spaltning af gen og plasmid
2. Til genet og det åbnede plasmid tilføres henholdsvis en enkeltstrenget polyA-kæde (genet) en enkeltstrenget polyT-kæde (plasmidet).
3. Vi ser, at der opstår to klæbrige ender, hvor gen og plasmid nu kan føres sammen. Dette er betinget af, at de 2 enkeltstrengede DNA- stykker nu er komplementære.
4. DNA-polymerase tilføres til de manglende nucleotider (T), hvor det hele afslutte med tilførelse af DNA-ligase.