Rettelse af et teoriafsnit, som jeg har skrevet

Rette det sproglige?

Nej det faglige, hr:)

Jeg har for ikke så langt tid siden skulle skrive en rapport om gensplejsning, mon du kan bruge dette:

Teori
Følgende opgave omhandler emnet gensplejsning med henblik på et eksperiment med bakterietransformation. For at forstå baggrunden bag det eksperimentelle forsøg og gensplejsning, vil jeg først beskrive nogle biologiske begreber, hvor der efterfølgende vil være en mere grundig biologisk forklaring:
Anvendt ”værktøj” til gensplejsning
Ved gensplejsning forstås omformering af gener ved overførsel af et organismes gen til en bakterie. De omformerede gener kan indsættes in en anden organisme, hvilket kunne være bakterier, der er prokaryote. De prokaryote celler skiller sig ud fra det eukaryote (dyreceller f.eks.) ved at de ingen cellekerne har, hvilket betyder at DNA’et (små ringformede DNA, såkaldte plasmider) ligger frit i cytoplasma. Desuden har disse bakterieceller ingen organeller med dobbeltmembran, hvor konsekvensen derfor er, at respirationen finder sted i cellemembranen. Meget kort opridset, har dyrecellerne (eukaryote) en cellekerne hvor i Dna’et ligger. Dyrecellen indeholder også mitokondrier, der er cellens ”kraftværk”. Plasmiderne, der er cirkulære DNA som replikere sig selv har umiddelbart vist sit at indeholde gener, der er resistens mod diverse antibiotika (udtrykket uddybes senere), hvilket benyttes i forbindelse med undersøgelse af gensplejsning. Man har fundet ud, at det under velvillige forhold er ret enkelt at transportere/overføre med plasmiderne mellem bakterierne, hvorfor bakterierne nemt udvikler resistens overfor antibiotika. Plasmiderne må siges at være helt unikke – de kan bære på det genetiske materiale, som flyttes fra den ene organisme og til en anden. Udover det nævnte indeholder bakterieceller også restriktionsenzymer. Disse enzymer kan klippe plasmider over ved bestemte basesekvenser – den ”klipper” ofte plasmiderne ved forskudte basesekvenser, såkaldte palindromiske sekvenser. Disse palindromiske sekvenser er forskudt, men samtidig symmetrisk klippet, hvilket danner grund til at enderne indeholder uparrede komplementære baser (se bilag 1). Det man får ud af det er klæbrige DNA ender, da DNA vil hænge sammen i basepar princippet.
Gensplejsning
Der findes flere metoder til gensplejsning af bakterie, hvor jeg kort vil redegøre for de ikke anvendte (/de uvæsentligt) i forhold til vores forsøg. Efterfølgende vil jeg give en mere detaljeret gennemgang af den anvendte metode.
1) Isolering af gener fra DNA: ved denne metode er det ret så svært at lokalisere det specifikke gen man ønsker at anvende, eftersom organismen man vil hente genet far indeholder utallige antal af gener. I første omgang benytter man sig at hele organismens arvemateriale mht. til gensplejsning fa DNA-stykker, hvor man efterfølgende isolere mikroorganismerne, der har fået indsplejset det ønskede gen.

2) Isolering af gener ud fra mRNA: genet for insulin kan dannes med udgangspunkt i mRNA, eftersom netop mRNA koder for insulin. I Bugspytkirtlen er der insulinproducerende celler, hvor man kan isolere mRNA fra. De dobbeltstrengede DNA kan dannes ved revers transkriptase, hvor revers er et enzym der katalyserer dannelse af DNA som aftryk af RNA. Det dannede DNA for betegnelsen komplementær-DNA – også såkaldt cDNA. Her undgår man introns, som er et område indenfor et som, som ikke findes kopieret i et endelig genprodukt. Eftersom bakterie ikke har et enzymsystem til at fjerne fra introns fra det transskriberede RNA, ville der forvolde problemer ved direkte anvendelse af insulingenet i en bakterie. Problemet undgås ved netop brug af cDNA, som i øvrigt er dannet fra noget der ikke indeholder introns, nemlig mRNA. Ved denne metode er det et problem ikke at kunne isolere det ønskede mRNA.

3) Isolering af gener ved syntetisk dannet DNA: en syntetisering er muligt ved kendskab til genets baserækkefølge. Altså, kender man aminosyrerækkefølgen i det valgte protein som genet koder for, kan man ved hjælp af den genetiske kode konstruere en baserækkefølge og efterfølgende syntetisere genet.

Indsplejsning i en vektor:
Det stykke DNA man har indsættes i en vektor, hvor en vektor er defineret ved, at den har som funktion at overføre det ønskede DNA til modtagecellen. Det indsatte DNA skal gerne kunne have egenskaben til at replikere sig selv . Enten anvendes et plasmid eller et virus som vektor – i vores tilfælde et plasmid. Plasmid er et dobbeltstrengt (små ringformet) DNA-molekyle, som kun indeholder få gener, der forekommer i bakterier og fordobles uafhængigt af bakteriekromosomet.
På samme vis som man skaffer et donorgen skaffes plasmider fra bakterieceller: man isoler plasmidet ved knusning af bakterien, hvor man efterfølgende ved centrifugering adskiller de de små plasmider fra det store bakteriekromosom. Her har man så plasmidet, nu ønskes det at få det ønskede donorgen indsat. Det kan lade sig gøre ved at åbne plasmiderne vha. de tidligere nævnte restriktionsenzym, som spalter fremmede DNA. Genet og plasmidet kan opnå at få de samme enkeltstrengede baser som er åbne i enderne – ved disse åbninger kan de lettere ”klistre sammen”.
Gensplejsning med plasmider har tre udfald, som ses på den nedenstående figur 2:
:
Af figuren ser vi de udfald som følgende:
1. Der forekommer en sammensplejsnig af plasmid og gen
2. Plasmidet lukker igen
3. Et plasmidring dannes ved sammenlukning af DNA-molekylet
Processerne fortsætter men tilførsel af DNA-ligase, hvilket er et enzym som ved dannelse af de nødvendige hydrogenbindinger mellem de 2 DNA strenge sammenføjer de sammenklæbede DNA-molekyler – dertil bør vi vide, at dette enzym anvendtes til cellens replikation af DNA før en celledeling. Ved tilførsel af DNA-ligase kan genet siges at være splejset ind i plasmidet.
Nu er det jo langt fra tilfældet, at alle gener har den samme længde. Ved forekomst af længere gener (med indhold store mængder DNA) må restriktionsenzymet spalte genet flere steder – derfor er det nødvendigt at anvende en anden metode.
Ved den anden anvendte metode slår man generne mekanisk i stykker, således at der er nok lange DNA-stykker med et stort gen. Herved kan de klæbrige ender laves syntetisk: med f.eks. en polyA-kæde på genet og en polyT-kæde på plasmidet. De føres da sammen med ligase og evt. manglende nucleotider. For at illustrerer det beskrevet, kan vi se på figur 3:

Af denne figur ser vi gensplejsning med syntetiserede klæbrige ender. Vi ser ligeledes 4 rækker, som jeg kort vil beskrive:
1. Mekanisk spaltning af gen og plasmid
2. Til genet og det åbnede plasmid tilføres henholdsvis en enkeltstrenget polyA-kæde (genet) en enkeltstrenget polyT-kæde (plasmidet).
3. Vi ser, at der opstår to klæbrige ender, hvor gen og plasmid nu kan føres sammen. Dette er betinget af, at de 2 enkeltstrengede DNA- stykker nu er komplementære.
4. DNA-polymerase tilføres til de manglende nucleotider (T), hvor det hele afslutte med tilførelse af DNA-ligase.
Genoverførsel til modtagercelle
Vektoroverførelsen foregå ved transformation, altså gennem cellemembranen, når vektoren er et plasmid. Man ønsker at behandle modtagercellen således, membran bliver yderligere permeabel (gennemtrængelig) over for plasmider, hvilket foretages med behandling af Calciumioner (Ca2+) og kuldebehandling. Kuldebehandlingen stimulerer ligeledes cellemembranens permeabelitet. Transformation vil som følge ad denne behandling forgå meget lettere.
At det indsplejsede gen har en promot er vigtig – evt. kan man splejse genet sammen med promoteren før gensplejsning. Man kan få aflæst genet ofte, hvis man anvender den type promotor, som binder RNA-polymerasen stærkt, hvilket betyder at meget at det ønskede stof syntetiseres.
Overførslen sker ved transduktion ved tilfældet af at vektoren er et. I bakterien eller i et bakteriekromosom optages genet, når bakteriophagen afgiver sit DNA-indeholdende gensplejsede gen til bakterien. Herefter kan genet fulgt af translation transkriberes, hvor man benytter en bakterieophag, der ikke er dræbende overfor bakterie.
Udvælgelsen af de celler som har fået indsplejset det relevante gen
Ikke alle bakterier er blevet gensplejset efter en gensplejsning. Har man foretaget gensplejsningen med en blanding af gener og ikke det helt specifikke gen som man ønskede at frembringe, vil det da være nødvendigt lokaliserer de bakterier, der har fået indsat det rigtige gen. Til dette er det simpleste at finde bakterien danner det ønskede protein. Eftersom, at protein produceres i meget små mængder, kan det være problematisk at påvise det specifikke protein. Som løsning til at påvise proteinet benyttes antistof, er det da et enzym man ønsker at påvise, da skak man teste enzynets evne til at katalysere en proces.
Ved kendskab til genets baserækkefølge, kan man også direkte påvise, at bakterierne indeholder deytrelevante gen. Ved brug af plasmid som vektor findes der en anden metode. Man kan således fremstille DNA-probe, hvilket vil sige, at man kan fremstille et enkelstrenget DNA de er komplementær til en af strengene i genet.
Hydrogenbindinger bliver ved opvarmning enstrenget i de forskellige bakteriers DNA og ved tilsætning af DNA-proben vil den kunne binde sig til genet, hvor man på den måde kan få lokaliseret genet.
For at finde ud af hvilke bakterier, der har optaget det gensplejsede plasmid ser man på sortering af bakterier gensplejset med plasmider. Eks, kan bakterierne modtaget visse resistensgener, hvis plasmidet, der er anvendt har indehold gener for resistens mod antibiotika.
Regulering af proteinsyntesen hos prokaryote organismer
For bakterierne er det vigtigt at syntetisere de relevante enzymer, da de i forskellige situationer har brug for at skifte deres stofskifte. Ligeledes er det vigtigt, at de ikke spiler aminosyrer og energi på producere unødvendige enzymer. For colibakterien f.eks., vil det være energispild at producere enzymer, der kan nedbryde laktose (mælkesukker), eftersom colibakteriernes omgivelser oftest ikke indeholder laktose. Derimod ville det være godt at kunne aktivere dannelse af enzymer, som kunne nedbryde laktose, hvis der var laktose i colibakteriernes omgivelser. Vi vil nu se på en hel unik situation, nemlig laktoseoperon:
Laktoseoperon
Ved udnyttelse af laktose hos colibakterierne, da skal der bruges to enzymer; nemlig enzymet galaktosid permase, der kan transportere laktosen over cellemembranen og ind i cytoplasmaet og det spaltende enzym ß-galaktosidase, der spalter laktosen til glukose og galaktose. Under normale forhold vil der kunne findes ca. 10 af de to nævnte enzymer i en colibakterie, dog vil indholdet af disse enzymer stige stødt ved en mulig udsættelse for laktose i bakterien.
En figur over laktoseoperon vil se således ud:

Generne for ß-galaktosidase og galaktosid permase ligger på bakteriekromosomet efterfulgt at et gen for enzymet transacetylase, der virker til at en uklar funktion i laktosestofskiftet. Der sker en transskription af de tre nævnte gener til mRNA som translateres til tre enzymer. Transskriptionen er betinget af, at der før ß-galaktosidase er en promotor hvortil RNA-polymerasen bindes. Et gen, der koder for repressoren findes på bakteriekromosomet, hvor repressoren bindes til et område lige før promotoren, kaldt operatoren – lige netop dette hindrer en transskribering ad generne ved RNA-polymerase. Eftersom repressoren er bundet til operatoren afbrydes transskriptionen efter RNA-polymerasen bindes til promotoren. For en mulig gentransskribering må repressoren inaktiveres. Eftersom repressoren er en allosterisk protein kan den ændre form dvs. at de få tilstedeværende ß-galaktosidase enzymer vil kunne omdannes noget laktose til allolaktose, hvilket medvirker at repressoren ændrer from, hvorved der ikke sker en binding til operatoren, når colibakterien udsættes for laktose. Hermed har vi brudt hindringen og RNA-polymerasen kan således transskribere generne og de nødvendige gener for laktosenedbrydelse kan nu dannes. Repressoren har en smart funktion, det hænger sammen med at repressoren vil komme tilbage til sin aktive form, idet al laktosen er nedbrudt vil det ikke kunne være noget allolaktose. Efterfølgende stoppes transskriptionen endnu engang, da repressoren bindes til operatoren.
Såfremt laktose og glukose er til stede så colibakterierne kan optage det, vil laktosenedbrydende enzymer ikke dannes – dog vil laktosenedbrydning finde sted, når glukosekoncentrationen er lav. Sammenhængen med dette findes ved regulering af cAMP (cyklisk AMP) – lige foran promotorområdet kan cAMP bindes til, hvor RNA-polymerasen først bindes til promotorområdet når cAMP er bundet lige foran. Mængden af cAMP afhænger af mængden af glukosen i cellen, ved lidt glukose i cellen vil der være meget cAMP, hvorved laktosenedbrydning kan finde sted. Modsat vil bakterien ikke spilde energi på laktosenedbrydende enzymer. Et operon er desuden stedet, hvor de er en promotor fulgt af gener, som koder for proteiner.

#3: det blev vidst ret så overskueligt
se http://peecee.dk/upload/view/98721
der er min rapport

Der er jo ingen der gider læse det

Jeg læste det og jeg finder det ikke brugbart for janisk rapport.

Janisk, hvis du fortalte om rapportens formål og forsøg, ville det være lettere at kommentere, om du har en rigtig faglig indgangsvinkel. Gensplejsning er et omfattende emne. Umiddelbart kan jeg ikke finde de faglige fejl.

Genetisk transformation med et indsat gen, isolation, mRNA og eukaryote - relevant. Isolationen med indholdig filtermateriale, T og A's forhold med baseparringsregler, dobbeltstrengede Dna stykker - cDNA, brug af vektorer.